Нова технологія ExIGS поєднала мікроскопію та секвенування ДНК

Дослідники з Гарвардського університету в Інституті Броуда повідомили про розробку революційної технології під назвою розширене секвенування геному на місці (ExIGS), яка дозволяє одночасно секвенувати ДНК та візуалізувати білки на нанорівні в окремих клітинах. Результати дослідження, опубліковані в журналі Science, демонструють, як ядерні аномалії пов'язані з осередками аберантної регуляції хроматину, що потенційно може призводити до втрати клітинної ідентичності.

Під мікроскопом клітини можна ідентифікувати за розміром, формою, структурою та зовнішнім виглядом органел. Морфологія ядра виявилася особливо важливою в патології, оскільки аномалії форми ядра або текстури хроматину є ознаками механістичних порушень, які часто допомагають діагностувати рак та захворювання крові. Геномне секвенування перемістило фокус на епігеномні, транскриптомні та протеомні вимірювання для визначення типів та станів клітин, дозволяючи дослідникам заглянути в потенційні причини морфології захворювань.

Мікроскопія спостерігає результат невдалого механізму, надаючи мало інформації щодо причинності. Секвенування може розкрити геномну основу змін, але не має тканинно-специфічного контексту в клітинному середовищі. Останні методи просторової геноміки, такі як ExIGS, почали інтегрувати мікроскопію та секвенування для картування транскриптомів у тканинах з роздільною здатністю окремих клітин.

У дослідженні під назвою «Розширене секвенування геному на місці пов'язує ядерні аномалії з аберантною регуляцією хроматину» дослідники розробили ExIGS для секвенування геномної ДНК та локалізації ядерних білків з нанорозмірною роздільною здатністю в окремих клітинах.

ExIGS проаналізував 63 здорові фібробласти шкіри для вимірювання приросту зчитувань після розширення та 109 фібробластів легень з широко використовуваної клітинної лінії, всі з візуалізацією маркерів ядерної оболонки та хроматину. Фібробласти від пацієнта з прогерією надали 196 ядер поряд з 63 ядрами від здорових контролів.

Зразки прогерії були обрані тому, що прогерія викликає швидке старіння ядра через дефектний білок ламін, і порушення в цих клітинах добре охарактеризовані в патології. Тканина серця миші та фібробласти від 92-річного донора розширили порівняння старіння.

У першій фазі зразки пройшли двоетапний процес закріплення для збереження як сигналів геномної ДНК, так і білків у розширюваній полімерній матриці. У другій фазі ампліфікація методом котячого кола генерувала клональні нанокулі в гелі. Нанокулі ампліконів екстрагуються та секвенуються на звичайній платформі Illumina. У третій фазі мультимодальні дані були інтегровані через обчислювальний конвеєр для захоплення того, яка ДНК була знайдена в якому місці всередині розширеної клітини.

Використовуючи ExIGS з розширеними зразками, було отримано більше ніж у 10 разів більше зчитувань ДНК на ядро, зберігаючи при цьому тривимірне розташування неушкодженим. Приблизно 33,6 відсотка зчитувань були картовані в межах 200 нанометрів від ядерних білків. Ділянки ДНК поблизу ядерної оболонки (ламіну) мали тенденцію бути неактивними, тоді як ділянки поблизу ядерних плям мали тенденцію бути активними.

У клітинах пацієнтів з прогерією ядерна оболонка потовщувалася та складалася всередину, створюючи невеликі ділянки, де активна ДНК була змушена наблизитися до оболонки та здавалася пригніченою. У нормальних, старих та клітинах серця миші ферменти, що зчитують гени, були рідкісними в межах 200 нанометрів від складок ламіну, що вказує на те, що такі складки припиняють активність близьких генів.

Автори роблять висновок, що організація ламіну діє як ключовий контролер генної активності, з аномальними складками ламіну, що створюють кишені замовченої ДНК, які можуть спричиняти клітинну дисфункцію при старінні та захворюваннях. ExIGS пропонує потужний новий спосіб картування того, як ядерна структура впливає на функцію геному, дозволяючи дослідження розладів, таких як прогерія, серцево-судинні захворювання та нормальне старіння.

Технологія ExIGS представляє значний прорив у галузі клітинної біології та медицини, оскільки вперше дозволяє дослідникам одночасно спостерігати структурні зміни в клітинах та розуміти їх геномні причини. Це особливо важливо для вивчення процесів старіння та розвитку захворювань, коли морфологічні зміни клітин можуть передувати клінічним симптомам.

Дослідження показало, що в здорових клітинах існує чітка просторова організація генетичного матеріалу, де активні гени розташовані далі від ядерної оболонки, а неактивні — ближче до неї. Ця організація порушується при патологічних станах, таких як прогерія, де деформації ядерної оболонки призводять до неправильного розміщення активних генів та їх пригнічення.

Методологія ExIGS включає три основні етапи. Спочатку клітини фіксуються в спеціальній полімерній матриці, яка зберігає як ДНК, так і білкові структури. Потім проводиться ампліфікація ДНК безпосередньо в тканині, створюючи мільйони копій кожного фрагмента ДНК у вигляді нанокуль. Нарешті, ці нанокулі секвенуються, а отримані дані інтегруються з мікроскопічними зображеннями для створення просторової карти геному.

Особливо цікавими виявилися результати дослідження клітин пацієнтів з прогерією — рідкісним генетичним захворюванням, що викликає передчасне старіння. У цих клітинах дослідники спостерігали характерні деформації ядерної оболонки, які створювали «кишені» пригніченої генної активності. Подібні, хоча й менш виражені зміни, були виявлені в клітинах від літніх донорів, що підтверджує зв'язок між структурними змінами ядра та процесами старіння.

Технологія також дозволила виявити роль ядерних плям — спеціалізованих структур, де відбувається обробка РНК. Виявилося, що гени, розташовані поблизу цих структур, мають підвищену активність, що підтверджує важливість просторової організації ядра для регуляції генної експресії.

Потенційні застосування ExIGS виходять далеко за межі дослідження старіння. Технологія може бути використана для вивчення розвитку раку, коли зміни в ядерній морфології є одними з перших ознак злоякісної трансформації. Також вона може допомогти в розумінні механізмів дії різних лікарських препаратів на клітинному рівні та розробці нових терапевтичних підходів.